Биологическая активность фоспренила на модели медоносной пчелы (Apis mellifera)

Автор: Батуев Ю. М., Березина Л. К., Наровлянский А. Н., Гробов О. Ф., Пронин А. В., Санин А. В., Карцев В. М., Бейко В. Б.

В последнее десятилетие на основе растительных терпенов в ЗАО «Микро-плюс», Россия, создан препарат фоспренил — экологически чистый полученный из природного сырья противовирусный препарат, обладающий широким спектром биологической активности. Фоспренил является продуктом фосфорилирования полипрeнолов хвои; известно, что фосфаты усиливают действие последних.

Фоспренил, зарегистрированный в РФ как противовирусный препарат (4), обладает широким спектром биологической активности, в частности, активизирует гемопоэз и стимулирует систему естественной резистентности (12, 11). Фоспренил активен и при вирусных инфекциях, переносимых иксодовыми клещами, например, клещевом энцефалите (3). Благодаря широкому спектру противовирусной активности, препарат нашёл широкое применение в ветеринарии (2, 3). Он эффективен против целого ряда вирусов. Проведённые исследования позволяют говорить о двух направлениях его противовирусного действия: прямое воздействие на жизненный цикл вируса и увеличение неспецифической резистентности организма хозяина. Исходя из этого, фоспренил был испытан на пчёлах с целью изучения его противовирусного действия и возможности повышения неспецифической резистентности организма не только теплокровных, но и насекомых.

У пчёл выделено не менее 18 вирусов (5, 6). Для испытаний использовался нитевидный вирус пчёл — единственный вирус медоносной пчелы, содержащий ДНК, и вирус острого паралича пчел, РНК-содержащий, один из наиболее широко распространенных вирусов, легко культивируемый в лабораторных условиях.

Нитевидный вирус вызывает заболевание с хроническим течением и постоянной, но незначительной гибелью пчёл. Наибольший процент поражения в больных семьях отмечен среди перезимовавших пчёл (может достигать к концу зимовки более 50%). Средняя продолжительность жизни пчёл в инфицированных семьях значительно сокращается. Если перезимовавшие пчёлы не успевают вырастить достаточно молодых пчёл, пчелиная семья сильно ослабевает или даже полностью погибает. В летнее и осеннее время поражённость пчёл вирусом не превышает 5% уровня (9, 10).

Вирус острого паралича был впервые выделен от пчёл в 1963 г.(7). Его часто обнаруживали в небольших концентрациях у внешне здоровых пчёл и долгое время считалось, что в естественных условиях он присутствует у пчёл только в виде латентной инфекции и вызывает гибель последних только при лабораторном заражении. В лабораторных условиях латентно протекающую инфекцию удавалось активизировать при помощи введения в гемолимфу пчёл чужеродных белков или других вирусов (8). Титрованием вируса на пчёлах была определена 50% летальная доза, которая при заражении методом микроинъекции в гемолимфу соответствовала примерно 100 вирусным частицам, а при скармливании с сахарным сиропом — 1011 частицам.

Ситуация с вирусом острого паралича коренным образом изменилась при появлении паразитического клеща варроа. В 1979 г. было установлено, что клещ может быть переносчиком вируса острого паралича, активизировать латентно протекающую инфекцию, при этом от острого паралича может происходить массовая гибель пчёл (1).

Материалы и методы

Для испытания фоспренила использованы пчёлы из семьи, инфицированной нитевидным вирусом естественным путём, так как в лабораторных условиях заразить пчёл этим вирусом сложно. Опыты поставлены в марте – апреле, в период клинического проявления заболевания пчёл, т. е. появления возле улья больных погибающих пчёл.

Наличие вируса в погибших пчёлах определяли с помощью реакции иммунодиффузии с имеющейся специфической сывороткой. Поскольку заболевших пчёл вылечить уже невозможно, была поставлена цель увеличить продолжительность жизни инфицированных, но ещё не заболевших пчёл из этой семьи. Было поставлено три опыта по 4 садка, в каждом по 10 пчёл. В первом садке пчёл кормили чистым сахарным сиропом, во втором — сиропом, содержащим 0.01мг/мл фоспренила, в третьем — 0.1 мг/мл и в четвёртом — 1 мг/мл. Наблюдение за пчёлами вели до их полной гибели.

Для испытания фоспренила при остром параличе использовали летних пчёл из здоровой семьи. Вирус острого паралича (штамм из музея культур ВИЭВ) титровали на пчёлах. Пчёл заражали при помощи микродозатора инъекцией вируссодержащего материала в гемолимфу. Была определена концентрация вируссодержащего материала, вызывающая гибель 50% пчёл (100 вирионов на пчелу). Поставлено три опыта, в каждом опыте использовано по 8 садков с десятью пчелами. В садках №1, 3, 5, 7 пчёлы за сутки до начала и в течение всего опыта получали сахарный сироп, содержащий 0,1 мг/мл фоспренила, в остальных садках — чистый сахарный сироп. В садках № 1 и 2 пчёл заражали дозой 1000 вирионов на пчелу, в садках № 3 и 4 — дозой 100 вирионов, в садках № 5 и 6 — дозой 10 вирионов и в садках № 7 и 8 пчёлам инъецировали стерильный физиологический раствор. Наблюдения за пчёлами вели до полной их гибели.

Испытания фоспренила в полевых условиях были проведены в апреле – мае на пасеке МГУ (г. Москва). В эксперимент были взяты четыре условно здоровые семьи пчел (две подопытные и две контрольные), аналогичные по количеству пчёл, расплода, запасу кормов и возрасту матки. Перед началом опыта была измерена площадь, занятая расплодом, а затем подопытные семьи были однократно обработаны фоспренилом (по 8 мл фоспренила в концентрации 4 мг/мл на рамку с пчёлами путём опрыскивания из мелкодисперсного распылителя). Эффективность воздействия препарата оценивалась по количеству расплода в подопытных семьях по сравнению с контролем через 45 дней после обработки.

Результаты исследований и обсуждение

Результаты лабораторных исследований представлены в таблицах № 1 и 2. В таблице № 1 приведены данные по средней продолжительности жизни пчёл, инфицированных нитевидным вирусом и получавших в качестве корма сахарный сироп с фоспренилом в различных концентрациях или чистый сахарный сироп (контроль). Каждое значение соответствует средней продолжительности жизни 10 пчёл в одном садке.

Существенное увеличение продолжительности жизни (18.2 дня) установлено для инфицированных пчёл, получавших сахарный сироп, содержащий 0.1 мг/мл фоспренила по сравнению с больными контрольными пчёлами (12.4 дня), что соответствует 46.8 %. (Примечание: средняя продолжительность жизни здоровых рабочих пчёл в летний период в норме около 30 суток).

В опытах с вирусом острого паралича была использована концентрация препарата в сахарном сиропе 0.1 мг/мл, показавшая лучшие результаты в опытах с нитевидным вирусом.

В таблице № 2 представлены данные по средней продолжительности жизни пчёл, инфицированных вирусом острого паралича в различных дозах и получавших в качестве корма сахарный сироп с фоспренилом или чистый сахарный сироп (контроль). Дополнительным контролем служили пчёлы, которым вводили стерильный физиологический раствор.

В опыте и в контроле все пчёлы, заражённые дозой 1000 вирионов на пчелу, заболели в острой форме и погибли на 2 – 6 сутки. Противовирусное действие препарата при этой дозе заражения не установлено. В опытах с использованием дозы 100 и 10 вирионов на пчелу противовирусное действие препарата проявилось в увеличении средней продолжительности жизни пчёл, соответственно, на 16.4% и 14.5% по сравнению с контролем.

В полевых испытаниях через 45 дней после обработки сотов с пчелами фоспренилом количество расплода в подопытных семьях увеличилось в 2.3 и 3.0 раза, тогда как в контрольных семьях соответственно в 2.0 и 2.2 раза. Отрицательного действия на работоспособность маток и на расплод препарат не оказал, но пока нельзя утверждать, что фоспренил обладает стимулирующим действием на семьи пчел, из-за малого числа семей пчел в опыте.

Таким образом, в лабораторных опытах показано явное противовирусное действие препарата в организме пчелы и, возможно, увеличение неспецифической резистентности пчел к неблагоприятным воздействиям, выразившееся в более динамичном развитии семей пчел, получавших фоспренил.

Таблица №1. Средняя продолжительность жизни пчел (в сутках), инфицированных нитевидным вирусом, получавших сироп, содержащий фоспренил в разных дозах, или чистый сахарный сироп (контроль)

Конц. фоспренила мг/мл	0,01	0,1	1,0	Контроль
Опыт 1	9,2	15,4	8,6	9,3
Опыт 2	12,4	18,5	12,7	12,3
Опыт 3	15,3	20,8	17,1	15,7
Среднее значение	12,3	18,2	12,8	12,4

Таблица №2. Средняя продолжительность жизни пчел (в сутках), зараженных разными дозами вируса острого паралича, получавших сироп, содержащий фоспренил в дозе 0,1 мг/мл, или чистый сахарный сироп.

Конц. фоспре-нила мг/мл	1000 вирио-нов	1000 вирионов + фоспре-нил	100 вирио-нов	100 вирионов + фоспре-нил	10 вирио-нов	10 вирионов + фоспре-нил	Контроль	Контроль с фоспре-нилом
Опыт 1	4,8	4,6	6,8	7,8	13,1	14,9	29,9	24,1
Опыт 2	4,5	3,3	6,6	7,9	12,9	14,6	23,4	24,2
Опыт 3	4,7	4,7	6,7	7,8	13,2	15,4	28,3	26,9
Среднее значение	4,7	4,2	6,7	7,8	13,1	15,0	27,2	25,1

Литература

1. Батуев Ю. М., Пчеловодство, 1979, 7, 10 – 11.

2. Деева А. В., Ожерелков С. В., Новиков А. Ю. и др.//Ветеринария, 1998, №3, с.15 – 21.

3. Ожерелков С. В., Тимофеев А. В., Новикова Г. П. и др.//Вопросы вирус, 2000, №1, т. 45, 33 – 37.

4. Санин А. В., Данилов Л. Л., Наровлянский А. Н. и др.//Автор. свид. №5004008/14 (071510) 01.10.91, патент AU 2005475 С1.

5. Allen M. F., Ball B. V.//Bee World, 1996, 77, (3), 141 – 162.

6. Bailey L; Ball B. V.//Honey Bee Pathology, Harcourt Brace Jovanoovich; Sidcup, Kent, UK; 1991, p.193.

7. Bailey L., Gibbs A. J., Woods R. D.//Virology, 1963, 21, 3, 390 – 395.

8. Bailey L., Gibbs A. J.//J. Insect. Patol., 1964, 6, 4, 395 – 407.

9. Clark T. B.//Amer. Bee J., 1977, 117, 5, 340 – 341.

10. Clark T. B.//J. Invert. Pathol. 1978, 32, 3, 332 – 340.

11. Danilov L. L., Maltsev S. D., Deyeva A. V. et. al.//Arch. Immunol. et Therop. Exp., 1998, v. 44, p. 395 – 400.

12. Sanin A. V., Narovlyansky A. N., Danilov L. L. et al.//Second Joint Meeting Inter.Citokine Soc. and Inter. Soc. For Interferon and Citokine Research, Ierusalem, Israel , 25 – 30 Oct., 1998.